北京哪里治疗白癜风 https://wapjbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/jzpj_p2/本报记者田明实习生梁楠
苹果科技创新团队是立足河南优势特色园艺作物成立创新团队，重点围绕苹果产业中存在的瓶颈问题，瞄准科研前沿，积极立项开展研究并取得可喜成绩。近日，河南农业大学该团队在生态环境领域国际著名期刊JournalofHazardousMaterials（中科院一区Top，IF=10.）在线发表了题为AsensitivevisualmethodforonsitedetectionofquarantinepathogenicbacteriafromhorticulturalcropsusinganLbCas12avariantsystem的研究论文，这是继苹果病毒病田间可视化检测研究（Plantbiotechnologyjournal；Jiaoetal,，中科院一区Top，IF=9.）后的又一成果。该研究开发了一个新型CRISPR/LbCas12a突变体蛋白，它比现有商品化LbCas12a蛋白具有更强的活性和更广泛的PAM序列适应性。借助此突变体蛋白并整合一套生物信息学分析流程，能够方便快捷的设计病原微生物的检测靶标位点，实现对检疫性病原物（苹果火疫病、西瓜细菌果斑病病原菌等）的田间可视化快速检测。
LbCas12a在分子诊断方面也有很大的应用前景，通过识别特定的dsDNA序列对ssDNA进行非特异性切割，特别适合于检测病毒和病原菌。虽然现有的基于Cas12a的核酸检测已经成为一种灵敏（aM级）特异的诊断方法，但仍需进一步完善。所需改进之一就是LbCas12a蛋白更倾向于识别基因组中频率较低的5’-TTTV-3’PAM（V表示A/G/C），这会阻碍crRNA靶标位点的设计，使得靶标位点选择过少。
该研究将5个突变（DR、GR、KV、YR和KR）同时导入LbCas12a蛋白从而产生相应的LbCas12a变体，称为LbCas12a-5M（图1A-B）。荧光检测显示，这些氨基酸突变可以在一定程度上显著提高其对TTTVPAM靶标的活性，并识别非常规TNTNPAM，保留更强大的反式切割活性；通过Michaelis-Menten动力学分析，LbCas12a-5M的催化效率（以Kcat/Km值表示）是LbCas12a-wt的1.2倍和2.5倍，表明LbCas12a-5M突变体比野生型蛋白活性更强，PAM适应性更广，更适合应用于核酸检测。
图2特异性检测位点设计与灵敏度分析
借助宏基因组分析软件Metaphlanv3.0，整合并开发了一套针对于细菌微生物的crRNA靶标设计流程。结合LbCas12a-5M可视化检测系统，可以不借助试验仪器，在田间30min之内，快速可视化检测苹果火疫病病原菌E.amylovora和西瓜细菌果斑病病原菌A.citrulli，灵敏度可以与qPCR媲美。该研究工作有助于更好地理解如何构思、建立和应用基于CRISPR/Cas12a系统的、稳定快速的诊断方法以用于病原菌检疫，适用于包括植物、动物、人类致病细菌以及土壤和环境中存在的有益或有害细菌在内的任何何细菌微生物的检测，这将有助于阻止细菌性疾病的传播和爆发。
河南农业大学青年英才焦健博士为该论文第一作者，冯建灿教授和郑先波教授为共同通讯作者，河南农业大学为第一单位及第一通讯作者单位，中国农业科学院郑州果树研究所刘崇怀研究员为合作作者参与了本项研究工作。该研究工作得到了国家自然基金（）、河南省科技攻关项目（）和河南农业大学青年英才项目（）以及河南省重大公益科技专项（No.）的资助。
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